生物技術概論~PCR過程為何要冷卻DNA溶液?

先列出一般PCR的反應程式：
以下所列之溫度與時間會因為使用的聚合酶以及預期DNA產物的長度差異而有所不同。不同的實驗需求，設計上會有所變更。

Initial denaturation : 95~98℃, 30 sec~5 minDenaturation : 95~98℃, 5~30 secAnnealing : 50~72℃, 10~60 secExtrnsion : 70~72℃, 15~60sec/1kb
(此步驟時間需乘以產物長度)
2.~4. 重複25~40次Final extension : 72 ℃, 1~20min
PCR反應需要加入的反應物有：作為反應模版的DNA、一對引子、dNTP、聚合酶、適當的buffer、水


分別敘述各步驟的作用：
Initial denaturation：初步變性，使模版DNA的雙股螺旋結構可以徹底的分開成單股。Denaturation：使經過聚合反應後的DNA分開成單股。Annealing：使引子與模版DNA形成雙股結合Extrnsion：聚合酶作用，利用與模版DNA對應的dNTP，從引子末端開始延長對應股。Final extension：確保聚合反應完成。所以您所問的"冷卻"應該是指Annealing的步驟。
DNA溶液指的是模版DNA或整個的反應物。

實驗設計時，必須注意 引子設計、產物長度、所使用的酵素。不可單純沿用學長或其他人所使用的反應步驟。以上三點只要有一個不同，反應步驟的溫度或時間設定就不同。

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課後休息，來聽歌吧！
"PCR之歌！！" 發揮PCR的潛能，看看還能做什麼更新奇的～～




2008-10-13 15:22:43 補充：
PCR 使用的buffer會依照所使用的聚合酶而有所不同 ,通常製造商會附上已經調配好的濃縮buffer. 為了使用計算上便利,大多是2倍,5倍或10倍濃縮.
buffer所提供的是穩定的酸鹼值環境, 以利反應進行. 主要像Tris-HCl, KCl等的平衡. 另外重要的是當作輔酶使用的鎂離子(由MgCl2提供), 適當的鎂離子濃度決定反應的效率以及DNA複製的準確性.

2008-10-13 15:22:53 補充：
不同的核酸聚合酶使用的buffer配方會有差異,但大致成分相似. 也有同樣的聚合酶使用不同的緩衝液, 達到不同的反應條件; 例如一般反應與GC-rich反應的差異.
(GC-rich是指模版DNA中具有65~70%以上的G或C的序列, 因為GC配對是3氫鍵,AT是2氫鍵. 所以GC-rich反應相對較困難)

DNA溶液是什麼?
就是含有DNA的溶液!

簡單條列式說明~PCR步驟過程
1.把待製DNA片段加熱至94度>>破壞氫鍵，解開雙股!
2.溫度降至50度左右，加入引子(一小段單股DNA)>>引導DNA聚合酶附著!
3.溫度提高至72度，加入DNA聚合酶和原料核苷酸(去氧核糖核苷酸)>>DNA聚合酶作用最適合溫度!
4.重複1~3!>>以2的N次方增加DNA!

2008-10-13 22:10:06 補充：
所以，"冷卻"大概指50度!
答案是:(A)使引子能利用氫鍵和目標基因的尾端結合

2008-10-13 22:11:23 補充：
請問ｄＮＴＰ是什麼？
dNTP指的是"三磷酸去氧核糖核苷酸"(是合成DNA的原料，有四種)
dNTP有四種，包含dATP, dCTP, dGTP,dTTP

2008-10-13 22:13:36 補充：
ｄＮＴＰ是什麼？
dNTP指的是"三磷酸去氧核糖核苷酸"(是合成DNA的原料，有四種)
dNTP有四種，包含dATP, dCTP, dGTP,dTTP
用什麼當ｂｕｆｆｅｒ？
10X"PCRbuffer" 意思是10倍的PCR緩衝溶液
PCR應該有專用的緩衝溶液。成份我去找找吧! (PCR的反應buffer中，通常會含有一些MgCl2)

2008-10-13 22:13:42 補充：
The reaction mixtures used in the PCR steps contained 1×PCR buffer (50 mM KCl, 10 mM Tris–HCl [pH 9.0], 1.5%. [vol/vol] Triton X-100), 1.5 mM MgCl2
主要的buffer應該是"Tris–HCl、Triton X-100?"
看了幾篇PCR問答，似乎緩衝溶液並非固定不變的!