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蝙蝠的食性十分多樣,大翼手亞目的果蝠以吃果實為主,但亦會吃花粉、花蜜。小翼手亞目的蝙蝠約70%的種類以吃昆蟲為主,其他則有吃花粉、花蜜,吃魚、青蛙,甚至有吃其他蝙蝠以及吸血為食等食性特化的種類。
為了便於取食不同的食物,蝙蝠亦發展出各種特化的構造,例如吃花蜜的蝙蝠鼻吻部與舌頭都較長,以便舔食花蜜;吃魚或其他小型脊椎動物的蝙蝠,腳特別有力,爪特別銳利,以便捕捉獵物;而吸血蝙蝠的犬齒特別大,薄而銳利,便於割裂皮膚,其臼齒則退化減少。此外吸血蝙蝠的唾液含抗凝血物質,使其能順利吸血。
在覓食的同時,蝙蝠也發揮重要的生態功能。果蝠由於常在植物間來回覓食,所以成為許多植物傳播花粉及種子重要的媒介。例如號稱果中之王的榴槤,就是靠果蝠傳花授粉才能結實。許多熱帶地區的植物必須仰賴果蝠傳播花粉與種子,否則就無法繁衍。因此果蝠的生態功能,對人類經濟活動有重大貢獻。至於食蟲性的蝙蝠,單獨一隻一個晚上的覓食就可能吃掉數百隻,甚至上千隻的昆蟲,其中不乏許多可能危害農作物的經濟害蟲,對控制害蟲的數量極為重要,因此食蟲蝙蝠也對生態與人類的經濟活動同樣具有重大影響。
台灣地區的蝙蝠僅台灣狐蝠及分布於金門的印度犬果蝠為食果性,其餘均屬食蟲性蝙蝠。台灣狐蝠的食物以桑科榕屬的果實為主;食蟲性蝙蝠所食用的昆蟲種類相當廣泛,包括鞘翅目(甲蟲)、鱗翅目(蛾類)、雙翅目(蚊類)等昆蟲;但不同種類的蝙蝠所取食的昆蟲相仍有差異。例如台灣葉鼻蝠以鞘翅目大型昆蟲為主食,台灣小蹄鼻蝠的食物則以鱗翅目的昆蟲為主。近期的研究中發現台灣彩蝠是台灣地區主要以蜘蛛做為食物的蝙蝠。
部分蝙蝠尚具有一些特殊的構造,譬如臺灣葉鼻蝠在其額頭部位具有一腺體構造,稱之為前額囊(frontal sac),上端有一開口,內有毛狀物,當蝙蝠緊迫、興奮時會外翻而出;前額囊亦可能與生殖行為有關。一般而言,雌雄蝠均有此一構造,惟雄蝠比較明顯可見。另外,葉鼻蝠科和蹄鼻蝠科的個體,不論雌雄,在恥丘上端均具有一對假乳頭(dummy or pubic nipple),其中有生殖經驗的母蝠最明顯可見;此一構造主要的功能為加強初生幼蝠攀附在母蝠身上的能力。此外,腳脛是指後肢膝關節至腳踝處,其長度也常被測量作為形質比較之用。